Nature子刊：N-myc蛋白相分离可选择性调控基因转录，为癌症药物研发提供新思路

MYC转录因子在大部分癌症中都存在失调以及过度表达的情况， 例如以MYCN基因扩增为特征的高危神经母细胞瘤。由此导致的N-myc蛋白过度表达可激活在低N-myc水平下并不活跃的基因，从而驱动细胞增殖、引起肿瘤进展。然而，升高的N-myc水平是否仅仅影响其与基因组中较低亲和力位点的结合，还是能够从根本上改变这些原本不活跃的基因的激活过程，目前尚不清楚。

相分离（phase separation）是指的是在一个体系中，不同物质组分之间由于相互作用差异而形成的具有不同物理化学性质的不同相（如：气态、液态、固态等），这些相在空间上可明显区分开来，油滴在水中漂浮便是生活中随处可见的相分离现象。近年来，相分离现象被发现与转录调控有关，相分离现象中形成的异常凝聚的转录产物，可能是高N-myc水平激活增殖相关基因的机制，但具体的作用过程有待探索。

近日，由加州大学旧金山分校 Xiaokun Shu 团队发表于 Nature Structural & Molecular Biology 题为 MYC phase separation selectively modulates the transcriptome 的文章， 借助SparkDrop化学遗传工具，通过活细胞荧光共定位成像等技术，明确了N-myc蛋白相分离过程的发生过程，以及相分离状态下N-myc蛋白在基因转录调控中的作用。

研究团队首先在Kelly细胞系（MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系）和SH-EP细胞系（MYCN非扩增的神经母细胞瘤细胞系）中观察了N-myc蛋白的分布情况。免疫荧光成像显示，N-myc在Kelly细胞的细胞核中形成了点状凝聚体（puncta），而SH-EP细胞中则没有这样的现象。

通过在SH-EP细胞中外源性过表达N-myc-mEGFP蛋白，研究人员发现， N-myc蛋白聚集体的形成与蛋白质的浓度有关。浓度低于如250 nM时，N-myc蛋白均匀分布在细胞核内；浓度达到500 nM时，大约30-50%的N-myc蛋白形成点状结构；当浓度在约300-400 nM时，则开始出现相分离现象，随着时间推移可以快速融合并形成球形，且具有液滴融合的特征，表现出液体样的行为。

a. N-myc蛋白的细胞定位情况；b. N-myc蛋白发生相分离与浓度相关

为了探究N-myc蛋白是否参与转录过程，研究团队检测了其与一些转录相关蛋白的共定位情况。细胞荧光共定位成像，N-myc蛋白与MAX蛋白（结合DNA时的伴侣蛋白）定位于同一聚集体。荧光原位杂交（FISH）实验显示，部分N-myc凝聚体位于TP53基因座上。此外，N-myc聚集体还包含了转录中介体（Mediator）、RNA聚合酶II的磷酸化形式（Pol II S5p），以及新生RNA。上述发现证明了N-myc凝聚体确实具有转录活性。

为了进一步探究凝聚状态的N-myc蛋白在转录调控中的作用，研究团队使用了一种名为“SparkDrop”化学遗传工具，旨在不改变N-myc蛋白浓度的情况下（相分离发生与蛋白质浓度有关），通过小分子物质来那度胺直接驱动相分离发生。

SparkDrop化学遗传工具示意图

研究团队发现，凝聚状态并不影响N-myc蛋白的核心转录功能。值得注意的是，大部分N-myc调控的基因不受相分离的影响。相较于未发生相分离的分散状态，只有不到3%的N-myc驱动基因出现了表达水平进一步上调，不到1%的N-myc抑制基因表达水平进一步下降。然而，这些少量的差异表达基因包括了在癌症发生过程中发挥了关键作用的原癌基因以及抑癌基因。此外，相分离显著增加了细胞增殖以及增殖相关基因的表达，说明其在癌症发生和发展中具有潜在的重要作用。

分散/凝集状态的N-myc蛋白对全局转录的影响

总之，N-myc蛋白可以通过相分离形成具有转录活性的凝聚体，尽管相较于分散状态只进一步影响了少部分基因的表达，但这些基因大多参与了癌症发生。这些发现揭示了N-myc蛋白的相分离现象参与在基因转录、细胞增殖，以及癌症发生的潜在机制，也为针对相分离聚集体的癌症药物研发提供了思路。