Vaccines：一种未修饰核苷mRNA带状疱疹疫苗免疫原性潜力的研制和评价

信使RNA （mRNA）疫苗作为一项新的生物技术发展，在对抗新出现的未知病原体以及高毒力和致病性病原体方面具有明显的优势。这些好处包括相对快速的研发过程和产生强大的免疫反应的能力，有效地平衡细胞和体液免疫。TLR7/8等免疫受体可以识别mRNA并直接激活先天免疫系统，导致I型干扰素的产生。因此，mRNA序列在作为蛋白表达模板的同时，也可以起到佐剂的作用。然而，I型干扰素的过量产生可能通过多种机制抑制mRNA翻译，导致蛋白表达下降，进而影响疫苗的免疫原性。

研究表明，假尿嘧啶修饰的mRNA序列可显著提高翻译效率和稳定性。因此，这种修饰策略已被大多数mRNA制药公司广泛采用。然而，尽管与假尿嘧啶修饰相关的翻译效率显著提高，但其激活先天免疫系统的能力显著降低，这可能会对疫苗的整体免疫原性产生负面影响。最近的研究还表明，假尿嘧啶修饰可能引起核糖体移框，导致脱靶免疫反应，这是一种值得仔细考虑的不利影响。在成本方面，假尿嘧啶比常规尿嘧啶贵约10倍，导致mRNA疫苗大规模生产期间费用较高。然而，随着对mRNA结构和功能研究的深入，加上人工智能技术的快速发展，开发优化mRNA疫苗的新途径和新方法正在出现。在此背景下，我们从密码子优化的角度，对未修饰的mRNA序列进行结构稳定性修饰，以提高其半衰期。这是为了提高蛋白质的翻译效率和免疫原性，并试图避免假尿嘧啶修饰策略。

水痘-带状疱疹病毒（VZV）作为一种重要的病原体，在全球公共卫生领域引起了广泛的关注。带状疱疹是一种由水痘病毒再活化引起的疾病，通常表现为皮肤上出现疼痛的局部水泡，给患者造成相当大的痛苦和经济负担。机体对VZV感染的防御主要依赖于T细胞反应。目前可用的VZV疫苗Shingrix已被证明可以显著激活人体的CD4+ T细胞免疫反应，提供强大的保护。此外，RNA分子具有先天的辅助作用，主要通过诱导I型干扰素的产生，从而引发强大的细胞免疫应答。因此，mRNA技术平台在VZV疫苗的开发中具有理论上的优势。

目前，带状疱疹疫苗的开发主要以糖蛋白E （glycoprotein E, gE）为主要抗原，因为它可以在体内诱导强大的免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫，对预防病毒感染和复发至关重要。因此，我们也将gE蛋白作为抗原进行带状疱疹mRNA疫苗的开发和研究。本研究旨在利用人工智能技术的优势，在考虑mRNA二级结构和密码子偏倚等关键因素的基础上，设计各种gE mRNA序列。通过体外表达实验，我们确定了最佳候选序列，并将其开发为VZV mRNA疫苗，随后在小鼠模型中进行了免疫原性评估。我们很高兴地报告，未经修饰的VZV mRNA疫苗显示出与阳性对照Shingrix相当的免疫应答，在某些情况下甚至优于阳性对照Shingrix。它诱导了比Shingrix更强的Th-1偏倚抗体反应，并增强了T细胞反应。我们希望我们的研究能为带状疱疹mRNA疫苗的开发提供新的见解，未来的工作将集中在提高疫苗的安全性和有效性，同时降低生产成本。

方法：考虑密码子偏好和二级结构等因素，利用人工智能（AI）设计几种VZV未修饰的gE mRNA序列。研究人员评估了优化后的mRNA序列在体外的蛋白表达水平，随后将其用于开发一种名为Vac07的疫苗，该疫苗被封装在脂质纳米颗粒（LNP）递送系统中。在小鼠中评价了Vac07的免疫原性。

设计和翻译成VZV gE蛋白的mrna。(a)不同设计的mRNA序列，以及它们各自的CAI和MFE值。其他相关参数列在右侧。（b,c）使用jetMessenger将gE mrna转染到HEK-293T或DC2.4细胞中。转染后24或48 h采集细胞，流式细胞术检测gE抗原表达

Vac07和Shingrix诱导的抗体和记忆性B细胞反应的评价。(a) VZV mRNA疫苗的配制程序示意图。(b)实验设计：C57BL/6小鼠分别用递增剂量的VZV mRNA疫苗Vac07 （n = 6）、0.1人剂量的Shingrix （n = 5）或PBS （n = 4）免疫。在指定时间点采集血液样本以测定抗体水平，在增强后28天采集脾脏和dln以进一步分析。(c) ELISA法测定抗ge IgG滴度，并显示终点滴度。(d)用ELISA法测定第28天抗ge IgG1和IgG2c滴度，并给出终点滴度。(e) IgG2c/IgG1比值。(f)用于识别类切换ge绑定MBC的门控策略。图中显示了一种代表性动物的数据。采用的门控策略如下：首先，对100万个细胞进行染色，使用IgM和IgD抗体排除未进行抗体类转换的细胞。然后用CD19和CD45/B220标记记忆B细胞。最后，用gE蛋白与两个荧光团（APC和BV421）偶联来标记gE结合特异性的类别转换记忆B细胞。图中的数字表示每个细胞群体相对于父控制步骤的百分比。右面板显示数据汇总结果。(g)流式细胞术分析dln和脾脏中IgDIgM ge特异性MBCs的频率。左图为流式细胞术代表性图，每个图显示3000个细胞计数。图中的数字表示切换类ge绑定MBCs的频率。数据以平均值±SEM表示。采用单因素方差分析和多重比较检验进行统计学显著性分析。n，表示无显著差异；* p≤0.05,*** p≤0.001。

Vac07和Shingrix诱导T细胞反应的评价。C57BL/6小鼠ig；在第0天和第14天分别接种递增剂量的Vac07或0.1人剂量的Shingrix。在增强后7天(a)或28天（b-f）取脾。(a)用2µg/mL gE抗原刺激脾细胞20小时。用ELISpot检测分泌IFN-γ-或il -2的T细胞频率。(b)用或不加2µg/mL gE抗原刺激脾细胞20小时。用流式细胞术测定12个AIM+CD4+ T细胞中疫苗2025、13、68 / 9的频率。左图显示流式细胞术代表性图，每个图显示细胞计数为20,000。图中的数字代表AIM+ CD4+ T细胞的频率。右面板显示数据汇总结果。(c)在Brefeldin a存在的情况下，用或不加2µg/mL gE抗原刺激脾细胞8小时，显示了用于分析小鼠脾脏中产生IFN-γ-、IL-2-、TNF-或il -21的CD4+ T细胞的门控策略。本文介绍了一种代表性动物的数据。采用的门控策略如下：首先对100万个细胞进行染色，使用CD3和CD4抗体鉴定CD4+ T细胞。然后用CD44和CD62L抗体标记记忆T细胞。

最后，使用四种细胞因子抗体（IFN-γ、IL-2、TNF、IL-21）鉴定细胞因子特异性记忆T细胞。图中的数字表示每个细胞群体相对于父控制步骤的百分比。右面板显示数据汇总结果。(d)流式细胞术检测分泌IFN-γ-、IL-2-、TNF-或il -21的CD4+ T细胞的频率。(e)流式细胞术检测AIM+ Tfh细胞。(f)检测OX40+CD137+CXCR5+CD4+ Tfh细胞中ICOS的表达。显示MFI值。数据代表平均值±SEM。采用单因素方差分析和多重比较检验进行统计学显著性分析。* p≤0.05,** p≤0.01,*** p≤0.001。**** p≤0.0001。

结果：与野生型（WT）序列相比，密码子优化的mRNA序列在体外的蛋白表达水平显著提高。在小鼠中接种Vac07疫苗显示出与Shingrix疫苗相当甚至优于Shingrix疫苗的免疫原性，其特点是更强的th1偏倚抗体反应和更强的th1型细胞反应。

结论：密码子优化的未修饰mRNA序列也可能是mRNA疫苗开发的一种可行方法。这些优化序列有可能降低生产成本，同时可能增强mRNA疫苗的免疫原性。使用这种方法开发的Vac07有望成为一种潜在的更有效和更具成本效益的VZV mRNA候选疫苗。

原文来源：Zhang S;  Wang X;  Zhao T;Development and Evaluation of the Immunogenic Potential of an Unmodified Nucleoside mRNA Vaccine for Herpes Zoster.Vaccines (Basel) 2025 Jan 13;13(1)