Nature：先天免疫抗菌防御的最后一击

当细菌进入人体时，先天免疫系统通常只需要几分钟就能识别出来，并启动免疫防御。

在这一过程中，识别细菌细胞壁成分的免疫系统NOD2受体发挥着核心作用。NOD2是一种胞内受体(图1)，主要由免疫细胞和肠粘膜细胞产生，可以识别分子胞壁酰二肽(MDP)——细菌细胞壁中普遍存在的成分。当被MDP分子激活时，NOD2会触发炎症反应，其中包括阻止细菌进入肠壁。然而，在NOD2受体识别MDP分子这一过程中，如何变化及发挥相关作用的目前仍然不清楚。

Figure | Molecular underpinnings of an inflammatory bowel disease [1]

2022年8月24日，Nature在线发表题为“Phosphorylation of muramyl peptides by NAGK is required for NOD2 activation”学术论文。免疫学家Veit Hornung课题组发现了NOD2受体识别细菌MDP过程中以前未知的一个关键中间步骤，揭示了氨基糖代谢和对细菌细胞壁的先天免疫之间的联系。

为了研究哪些基因参与了细菌MDP识别过程，研究人员在培养的单倍体细胞KBM-7中进行了正向遗传筛选。通过构建红色荧光蛋白（mScarlet）融合表达IL-1β的KBM-IL-1β^mScarlet细胞株，并在MDP刺激下基于CRISPR技术对IL-1β正负调控因子进行筛选突变，利用深度测序的方式统计并计算基因突变的富集度，最终结果显示102个基因可正向调控MDP依赖的IL-1β- mScarlet的表达。除了IL-1β本身，还发现了NOD2信号通路的其他组成部分的基因，包括NOD2、RIPK2和XIAP，以及许多编码参与NF-κB和MAPK信号转导的基因。除了这些预期的组成部分，令人惊喜的是，数据中发现NAGK是一个非常重要的基因。

NAGK是糖激酶/Hsp70/肌动蛋白超家族的成员之一，以依赖于ATP的方式使某些底物磷酸化。随后的分子生物学和生化研究相关数据表明，NAGK在导致促炎基因表达的MDP识别中过程中具有重要作用，并且独立于该酶在糖代谢中的功能。

Fig. 1 | A haploid genetic screen reveals regulators of NOD2.

为了进一步探究NAGK对于识别MDP过程中发挥怎样的功能？研究者利用CRISPR/Cas9技术建立了NAGK敲除细胞株，并通过对比野生型与NAGK缺失型细胞株在MDP类似物刺激处理下，NOD2受体相关信号通路分子的表达情况，最终确定了NAGK是NOD2受体上游所特需的，而非其它促炎信号通路所需要的。

Fig. 2 | NAGK is required for MDP recognition

NAGK在NOD2中的上游作用提示NAGK要么在MDP摄取中起作用，要么直接修饰MDP使其具有刺激性。在NAGK缺失的情况下，荧光标记的MDP的摄取不受影响；根据假设，为了评估NAGK是否能直接磷酸化MDP，研究者在大肠杆菌中表达了重组人NAGK，并将其用于不同底物的体外激酶活性测定。通过薄层层析(TLC)显示了磷酸盐向各自底物的潜在转移；结果表明，L18-MDP在体外不能被NAGK磷酸化，但在细胞内以NAGK依赖的方式发挥强大的NOD2刺激活性，直接将MDP C6位的OH基上磷酸化，生成磷酸化的MDP。

Fig. 3 | NAGK phosphorylates MDP to render it NOD2-agonistic.

为了进一步探究NAGK是否对小鼠原代细胞中的NOD2信号转导必不可少？研究者通过靶向CRISPR-Cas9介导的NAGK基因外显子2-5的缺失来产生NAGK缺陷小鼠。从野生型和NAGK^−/−小鼠中获得了骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，并在干扰素诱导的条件下进行了研究。与用细胞系获得的结果一致，用ELISA法测定，NAGK^−/−BMDM在MDP刺激下不产生肿瘤坏死因子或IL-6。除此，经MDP刺激后，野生型细胞中有1,041个亚磷酸盐显著上调，298个亚磷酸盐显著下调。而NAGK^−/−BMDM在刺激后仅有4个亚磷酸盐发生显著改变。结果表明原代小鼠巨噬细胞需要NAGK来感知NOD2激动型刺激。

Fig. 4 | NAGK is essential for NOD2 signalling in mouse BMDMs

综上所述，研究者发现氨基糖激酶NAGK可将MDP C6位的OH基上磷酸化，生成磷酸化的MDP；MDP的这种NAGK依赖性磷酸化是使宿主的病原体相关模式分子NOD2识别的关键。即NOD2要确定其目标分子MDP，必须首先被NAGK转化为其磷酸化形式。NAGK的这一作用以前是未知的，并且独立于该酶在糖代谢中的功能。除此，研究者表示，由于NOD2基因的突变与克罗恩病有关，推测NAGK也可能在炎症性肠病的发生发展机制中有着一定的关系。

参考文献：

[1] Plevy S. A molecular connection hints at how a genetic risk factor drives Crohn's disease. Nature. 2021 May;593(7858):201-203. doi: 10.1038/d41586-021-00979-z.

原文：Stafford CA, et al. Phosphorylation of muramyl peptides by NAGK is required for NOD2 activation. Nature. 2022 Aug 24. doi: 10.1038/s41586-022-05125-x.