震撼来袭！广中医三附院揭秘：巴戟天神奇细胞外囊泡助力骨质重塑，MAPK信号通路成关键！

绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种系统性骨病，其显著特征为低骨量及微结构损伤。随着病情不断演进，患者逐渐出现背痛、骨质疏松性骨折、脊柱畸形及多器官功能障碍等诸多症状，为绝经后妇女带来沉重的生理、心理与经济负担。目前，临床上虽已有抗骨质疏松药物可供使用，但治疗周期长，且伴随全身性副作用，患者依从性普遍较低。因此，亟待研发更为高效且安全的药物，以应对PMOP的治疗挑战。

巴戟天（MO）在中国拥有悠久的医疗历史，其应用广泛涉及骨折与关节疾病的治疗领域。研究表明，MO富含多种具备显著抗骨质疏松活性的成分，这些成分主要包括多糖、低聚糖、蒽醌、环烯醚萜类以及糖苷等。然而，尽管MOEVLPs作为从巴戟天中提取的活性成分之一，其针对抗骨质疏松的具体作用及机制尚未获得全面而深入的研究。

近日，一篇名为“Morinda Officinalis-derived extracellular vesicle-like particles: Anti-osteoporosis effect by regulating MAPK signaling pathway ”的文章探究了其抗PMOP的相关作用。

图1 论文首页

MOEVLPs的抗PMOP功效

研究通过动物活体成像系统的监测，发现MOEVLPs展现出了显著的骨靶向能力（图2A）。特别是在（DiR）-MOEVLPs给药后24小时，骨荧光信号最为显著，表明MOEVLPs已有效靶向至骨骼部位。此外，在给药后48小时，仍有大量的DiR-MOEVELPs存在于骨组织中（图2B-2C），进一步证实了其骨靶向作用的持久性，为后续研究奠定了坚实基础。

随后，研究团队构建了PMOP小鼠模型，并利用阿仑膦酸钠作为阳性对照药物，对模型小鼠进行为期21天的MOEVLPs处理（图2D）。21天后，卵巢切除术（OVX）组小鼠的子宫指数显著高于假手术（Sham）组小鼠，表明模型构建成功。同时，高MOEVLPs组和低MOEVLPs组小鼠的子宫指数介于OVX组和Sham组之间，且高浓度组小鼠的子宫指数明显高于阿仑膦酸钠阳性药（ALN）组，表明设定的MOEVLPs浓度合理，并显示出良好的抗PMOP效果（图2F）。

在正式实验中，研究利用Micro-CT技术对MOEVLPs的抗PMOP效果进行了验证。通过骨微观结构的2D标测（冠状位图）和3D重建，经灌胃给予MOEVLPs的小鼠能够有效减少骨丢失并缓解PMOP症状（图2E）。且骨体积（BV）、骨量/总体积（BV/TV）、骨表面积（BS）、骨表面积/总体积（BS/TV）和组织矿含量（TMC）等参数均呈现出显著增加的趋势，而骨小梁分离度（Tb.Sp）则明显降低（图2G-K）。

综上所述，MOEVLPs具有显著的抗PMOP活性，且通过灌胃给药的方式可以有效地递送MOEVLPs，从而达到治疗PMOP的目的。

图2 MOEVLPs对OVX小鼠的抗骨质疏松作用

研究者针对处理后的不同组小鼠，进行了心、肝、脾、肺及肾组织切片的HE染色分析确认了MOEVLPs对上述器官并未造成任何损伤。同时，股骨组织的HE染色观察，不仅验证了模型的构建成功，还证实了MOEVLPs在缓解PMOP方面的显著效果（图3A）。

为阐明MOEVLPs的抗骨质疏松作用机制，研究实施了骨组织的免疫组织化学检测，重点观察了成骨分化标志物RUNX2和OCN的表达情况。结果显示，在为期21天的灌胃给药后，MOEVLPs显著增强了RUNX2和OCN的表达，特别是在较高浓度的MOEVLPs处理下表现尤为突出（图3B-3C）。表明MOEVLPs主要通过促进骨形成而非增加骨吸收的途径来有效减轻骨质疏松症的病理状态。

图3 MOEVLPs的安全性和成骨特性

MOEVLPs能有效促进MC3T3-E1细胞增殖

研究者选定了MC3T3-E1和BMSCs这两种广泛应用的细胞系，以进行后续的成骨分化研究。研究初期结果显示，当MOEVLPs悬浮液的浓度达到1 × 108个粒子/mL和1 × 109个颗粒/mL时，显著促进了MC3T3-E1细胞的增殖过程（图4A-4B）。

随后，为了更全面地了解MOEVLPs在细胞内的吸收情况，研究开展了内化吸收实验（图4C）。通过流式细胞术分析，研究者观察到MC3T3-E1细胞中带有荧光信号的百分比随着孵育时间的延长以及MOEVLPs浓度的提高而逐渐上升。特别是在MOEVLPs浓度为1 × 109个颗粒/mL，且孵育时间为8小时的条件下，含有MOEVLPs的细胞比例高达98.84%。

此外，通过共聚焦显微镜观察，研究进一步确认了MOEVLPs被MC3T3-E1细胞有效吸收，并定位于细胞的细胞质中。同时，荧光强度也呈现出与共孵育时间延长及MOEVLPs浓度增加相一致的增强趋势（图4D）。这些实验结果为进一步解析MOEVLPs在抗PMOP机制中的作用提供了有力的数据支持。

图4 MC3T3-E1细胞有效摄取MOEVLPs

此外，研究选定了两种浓度，即5× 108个粒子/mL和1 × 109个粒子/mL，针对MC3T3-E1细胞展现出最佳内化效果的MOEVLPs，进行了骨髓基质细胞（BMSC）的内化吸收实验（图5A）。流式细胞术的分析表明，在孵育8小时且MOEVLPs浓度为1×109的条件下，BMSCs的内化吸收率仅为67.2%，这一比例明显低于MC3T3-E1细胞对MOEVLPs的内化吸收效果（图5B）。此外，共焦图像的结果也进一步印证了上述结论（图5C）。细胞对MOEVLP的完全内化和吸收能力，是评估MOEVLPs对细胞作用程度的关键因素。因此，基于上述实验结果，研究选定MC3T3-E1细胞作为后续研究MOEVLPs减轻PMOP机制的主要细胞类型。MC3T3-E1细胞是常用于研究成骨分化机制的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞。茜素红测定法结果表明，MOEVLPs在促进钙结节形成方面并未展现出显著效果（图5D）。这与之前CCK-8实验的结果相一致，证实MOEVLPs对MC3T3-E1细胞的主要作用在于促进细胞增殖。

图5 MOEVLPs在骨髓间充质干细胞内化和MC3T3-E1成骨分化促进中的无效作用

MOEVLPs通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖

为了深入探究MOEVLPs对MC3T3-E1细胞增殖机制的影响，研究采用MOEVLPs处理MC3T3-E2细胞，并设定粒子浓度为1× 109个/mL。随后，在24、48和72小时的时间节点，分别收集了107个细胞进行蛋白质组学分析。同时，为了确保实验结果的可靠性，收集了同等数量的未经任何处理的MC3T3-E1细胞作为对照组。

通过GO和KEGG通路分析，研究者观察到在MOEVLPs处理下，MC3T3-E1细胞中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路被显著激活（图6A）。进一步分析发现，与MAPK通路相关的关键蛋白，如CREB和RSK1，其表达水平亦呈现出显著增长趋势（图6B-6C）。特别是，MAPK通路在调控细胞基本过程，如增殖、分化和凋亡等方面，具有显著作用。

同时，为验证MAPK信号通路在MOEVLPs促进MC3T3-E1细胞增殖过程中的关键作用，研究在经MOEVLPs处理的MC3T3-E2细胞上应用了MAPK通路抑制剂PD98059。结果表明，PD98059有效抑制了MOEVLPs的增殖作用（图6D）。此外，免疫印迹分析亦显示，在MOEVLPs处理后，MC3T3-E1细胞中CREB和RSK1的表达水平显著上升，而PD98059的应用则逆转了这一表达趋势（图6E-6H）。

因此，这些实验结果充分证实了MAPK信号通路及其相关蛋白在MOEVLPs促进MC3T3-E1细胞增殖过程中的重要作用和意义。

图6 MOEVLPs促进MC3T3-E1增殖机制的生物信息学分析和验证

结论

总之，该研究已成功分离出高质量的MOEVLPs，并证实其能够通过MAPK途径有效促进成骨细胞增殖，进而缓解PMOP症状。此外，研究还揭示了MOEVLPs具有成为新型天然抗PMOP药物的巨大潜力，为今后的药物研发提供了新的思路和方向。

参考文献：

Cao Y, Tan X, Shen J, Liu F, Xu Y, Chen Y, Zhou S, Qiu T, Li D, Zhao Q, Zhao K. Morinda Officinalis-derived extracellular vesicle-like particles: Anti-osteoporosis effect by regulating MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 2024 Apr 10;129:155628. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155628